Figura 2 – Recombinação e expressão dos genes do TCR. Codificação da região variável da cadeia b a partir da recombinação dos éxons Db1 com o 5º éxon do agrupamento Jb1 que, em seguida, recombinam com o éxon Vb1. Posteriormente os segmentos recombinados Vb1Db1Jb1 recombinam-se com o segmento constante Cb1. Uma vez rearranjado o DNA é transcrito em RNA mensageiro que, conseqüentemente, é traduzido em uma cadeia polipeptídica equivalente à cadeia b do TCR. Na seqüência à direita está representado o processo de recombinação que resultará na formação da cadeia a do TCR a partir da recombinação dos éxons Va1 e Ja1.

Figura 3 – Migração dos precursores do LT da medula óssea para o timo e diferentes estágios de maturação do LT. No córtex tímico, além dos rearranjos para geração do TCR, ocorre expressão dos co-receptores CD4 e CD8, momento a partir do qual inicia-se o processo de seleção tímica. São eliminados os timócitos auto-reativos e cujos TCRs ligam-se ao MHC com alta afinidade. Na medula tímica ocorre a diferenciação funcional e fenotípica e as células maduras são liberadas para a circulação.

fornece uma medida indireta da função tímica e do grau de proliferação periférica das células T.

Maturação dos linfócitos T

O processo de maturação dos LT ocorre em etapas seqüenciais que envolvem a recombinação somática e expressão do TCR, proliferação das células, expressão dos co-receptores CD4 e CD8 e seleção positiva e negativa induzida por apresentação de antígenos próprios por células do estroma tímico (Figura 3).

Na primeira etapa da maturação ocorre o rearranjo dos genes da cadeia b do TCR e, em seguida, da cadeia a. Em seguida os timócitos, ou linfócitos imaturos, começam a expressar baixos níveis de CD4 e CD8 na superfície, sendo, portanto, duplo-positivos. Nesta fase, os timócitos migram em direção à medula tímica e entram em contato com antígenos próprios apresentados pelas células epiteliais do estroma tímico. Apenas os timócitos que se ligam ao complexo MHC/antígeno com afinidade adequada recebem estímulo para sobreviver. Esse processo é conhecido como seleção positiva. Os timócitos cujo TCR não apresenta nenhuma afinidade pelo MHC próprio sofrem apoptose pela falta de estímulo, processo este denominado morte por negligência. Nesta fase, a interação com moléculas MHC de classe I ou II determinam a diferenciação do timócito em linfócito T CD8+ ou CD4+, respectivamente. Continuando o processo de maturação, os timócitos ab que sobreviveram à seleção positiva e expressam apenas CD4 ou CD8 vão em direção à medula onde entram em contato com células dendríticas e macrófagos que são células apresentadoras de antígenos (APCs) extremamente eficientes. As APCs apresentam antígenos próprios associados ao MHC. Os timócitos imaturos que interagem com muita afinidade com esses complexos morrem por apoptose. As células que sobrevivem tanto à seleção positiva quanto negativa tornando-se linfócitos maduros, prontos para deixarem o timo e exercerem suas funções na periferia. Apenas cerca de 5% das células que entram no timo tornam-se linfócitos T maduros.

Este processo de educação tímica visa garantir que os LT circulantes sejam tolerantes aos antígenos próprios, mas capazes de reconhecer antígenos estranhos ao organismo quando apresentados pelo MHC próprio. Entretanto os mecanismos centrais de tolerância não são absolutos uma vez que LT auto-reativos podem ser encontrados na periferia. Entre outros mecanismos de regulação periférica, destacam-se diferentes populações de linfócitos reguladores que atuam na periferia para impedir o desenvolvimento de auto-imunidade.

Células T efetoras

As células T são razoavelmente heterogêneas e diversos subtipos têm sido progressivamente identificados (Figura 4). Classicamente os dois maiores subtipos de células T efetoras foram identificados como células T auxiliares (Th) e células T citotóxicas, compartilhando em sua superfície um receptor TCR ab e as moléculas co-receptoras, CD4 ou CD8, respectivamente. Os linfócitos T (LT) CD4 são responsáveis por orquestrar outras células da resposta imune para erradicar patógenos e são também muito importantes na ativação dos linfócitos B (LB), macrófagos ou mesmo LT CD8. As células T CD8 estão envolvidas principalmente nas repostas antivirais e possuem também atividade antitumoral. Ambos os subtipos apresentam papel muito importante no controle de patógenos intracelulares. O modelo dicotômico de diferenciação das células T auxiliares Th1/Th2 é compatível com diversos modelos de respostas a agentes infecciosos, mas sua inserção nos modelos de doenças auto-imunes sempre foi um assunto problemático, até a recente descoberta de uma nova linhagem de células Th, as células Th17. Esta nova subpopulação de LT produz citocinas pró-inflamatórias importantes na erradicação de patógenos extracelulares e tem sido associada ao desenvolvimento de doenças auto-imunes em modelos murinos. Recentemente seu papel imune-efetor tem sido extensamente estudado em humanos. Um outro subtipo de LT, encontrado especialmente nas barreiras de mucosa e na pele, são os LT gd. Essas células são importantes nas respostas imunes contra antígenos comumente encontrados nesses sítios anatômicos e representam um elo entre a resposta imune inata e adaptativa.

Células T CD4 auxiliares (Th)

As células Th são subdivididas funcionalmente pelo padrão de citocinas que produzem. Durante o estímulo fornecido por uma célula apresentadora de antígenos (APC), um linfócito precursor Th0 pode se tornar uma célula Th1, Th2 ou Th17, na dependência do ambiente de citocinas presente. Embora morfologicamente indistinguíveis essas células apresentam distintos padrões de citocinas secretadas e, conseqüentemente, diferentes repostas efetoras (Figura 4).

Células Th1
As células Th1 produzem grandes quantidades de IL-2, que induz proliferação de LT (incluindo as próprias células T CD4 de maneira autócrina). A IL-2 também induz a proliferação e aumenta a capacidade citotóxica dos LT CD8. A outra citocina produzida em grandes quantidades pelas células Th1 é o INF-g, uma citocina muito importante na ativação de macrófagos infectados com patógenos intracelulares como micobactérias, protozoários e fungos. O INF-g apresenta também um papel relevante na ativação de LT CD8. A importância desta citocina produzida por LTh1 pode ser observada nos pacientes com síndrome de imunodeficiência em que o receptor de INF-g está ausente, que sofrem de infecções graves por micobactérias. As citocinas Th1 são as grandes indutoras das respostas inflamatórias mediadas por células nas lesões granulomatosas da tuberculose. Existe um ciclo de retroalimentação positiva na ação do INF-g sobre outras células Th0, induzindo a polarização das mesmas para a via de diferenciação Th1 e inibindo a via Th2. A resposta Th1 é essencial para o hospedeiro no controle da replicação de patógenos intracelulares, sendo possível que contribuam para a patogênese de algumas doenças reumáticas auto-imunes como artrite reumatóide (AR) e esclerose múltipla (EM). Entretanto, nos últimos anos, as células Th1 vêm deixando de ser vistas como participantes centrais em modelos experimentais de AR e EM. Em seu lugar, uma nova subpopulação de LT, os LTh17, tem sido responsabilizada pelo processo fisiopatológico destas enfermidades.

Figura 4 – Características gerais das células T auxiliares, subtipos Th1 e Th2, células Th17, linfócitos T citolíticos e linfócitos Tgd.

Células Th2
A segunda população Th muito importante nas repostas imunes humorais é LTh2, que produz IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10, favorecendo a produção de anticorpos. As respostas Th2 estão associadas com as doenças alérgicas e infecções por helmintos, uma vez que a IL-4 induz a troca de classe de imunoglobulinas nos linfócitos B para IgE e a IL-5 induz a produção e ativação de eosinófilos. De forma análoga ao INF-g, a IL-4 também promove uma retroalimentação positiva para a via Th2 e suprime a via Th1. Em situações de hipersensibilidade imediata, como nas doenças alérgicas, a terapia visa a dessensibilização imune Th2 e indução de respostas Th1 alérgeno-específicas. Já em doenças sabidamente causadas por células Th1, as citocinas Th2 têm sido consideradas protetoras, portanto a busca pela alteração no padrão de resposta imune de Th1 para Th2 tem sido muito estudada em pesquisas que visam a melhora ou o restabelecimento da tolerância imunológica. Com o recente reconhecimento do importante papel das células Th17 nos processos auto-imunes esta teoria tem sido questionada.

Células Th17
Os linfócitos Th17 representam um novo subtipo de linfócitos T efetores importantes na proteção contra infecção por microorganismos extracelulares. Foram originalmente descritos em modelos de doenças auto-imunes experimentais como encefalite auto-imune e artrite induzida por colágeno, doenças que antes se acreditava serem causadas por células Th1. Esta nova via de diferenciação Th começou a ser elucidada com a descoberta da citocina IL-23. Esta citocina é um heterodímero que compartilha uma subunidade com a IL-12, chamada IL-12p40, e possui uma subunidade específica, a IL-23p19. Em modelos experimentais de auto-imunidade, observou-se que camundongos nocaute para IL-12p40 apresentavam desenvolvimento atenuado de doença auto-imune, já os animais nocaute para o complexo do receptor de IL-12 (citocina ligada à via Th1) desenvolviam a doença normalmente. Outra evidência interessante foi a descoberta de que anticorpos contra subunidade IL-12p40 são eficazes no tratamento da doença de Crohn.

Uma das maneiras pelas quais a IL-23, juntamente com IL-1 e IL-6, pode levar ao desenvolvimento de doenças auto-imunes refere-se ao seu importante papel indutor da diferenciação e ativação de células Th17, que produzem citocinas pró-inflamatórias, IL-22, IL-26 e citocinas da família IL-17, características destas células. As citocinas da família IL-17 são potentes indutoras da inflamação, induzindo a infiltração celular e produção de outras citocinas pró-inflamatórias.

A produção desregulada de IL-17 está associada a inúmeros distúrbios auto-imunes, como esclerose múltipla, doença intestinal inflamatória, psoríase e lúpus, tendo sido também encontrada em níveis aumentados na sinóvia inflamada de pacientes com artrite reumatóide, onde atua como um importante fator na ativação dos osteoclastos e reabsorção óssea.

A via de diferenciação Th17 é antagonizada pelas citocinas Th1 e Th2 e, em alguns modelos experimentais de auto-imunidade causada por células Th17, as citocinas Th1 e Th2 têm se mostrado protetoras. Um aspecto interessante das células Th humanas é sua maior plasticidade de diferenciação quando comparadas às células Th murinas. Células T produtoras de IL-17 são prontamente identificadas em populações de LT CD4 de memória em humanos, embora seu comprometimento com a linhagem específica Th17 seja menos evidente, pois em humanos estas células produzem tanto IL-17 como citocinas Th1 (INF-g). Além disso, ao contrário das células Th17 murinas, facilmente induzidas pela combinação das citocinas TGF-B e IL-6, estas citocinas são completamente ineficientes na geração de Th17 humanas. Por outro lado, a IL-23, que em camundongos não é o fator mais eficiente na indução de diferenciação de Th17, em humanos é efetiva em promover a produção de IL 17 por linfócitos T.

A exata compreensão dos mecanismos de polarização Th em humanos é fundamental para um melhor entendimento dos mecanismos fisiopatológicos das doenças inflamatórias crônicas e para o possível desenvolvimento de formas mais eficazes de imunoterapia.

Células T citotóxicas (CD8)

Os LT CD8 reconhecem antígenos intracitoplasmáticos apresentados por moléculas MHC de classe I, que são expressas por praticamente todas as células nucleadas. Células infectadas por vírus e células tumorais normalmente são reconhecidas pelos LT CD8. Após adesão a células-alvo apresentando um antígeno associado ao MHC e co-estímulo adequado, os LT CD8 proliferam e, em um encontro subseqüente, podem eliminar por citotoxicidade qualquer célula que apresente esse antígeno especifico, independente da presença de moléculas co-estimulatórias. Os LT CD8 apresentam grânulos citoplasmáticos contendo perforinas e granzimas. As primeiras abrem poros na membrana da célula-alvo e as granzimas passam através destes poros e, no citoplasma da célula-alvo, ativam enzimas chamadas caspases que induzem a fragmentação do DNA, levando a célula a entrar na via de morte celular programada (apoptose). Os LT CD8 também podem mediar citotoxidade pela expressão do receptor Fas L (CD95) que ao interagir com a molécula Fas da células-alvo ativa também caspases que vão levar à apoptose. A ativação dos macrófagos pelas citocinas de LT CD4 e o papel dos LT CD8 em eliminar células infectadas por vírus ou tumorais são de fundamental importância no controle de infecções que não foram eliminadas pelo sistema imune inato.

Células T gd

A maioria das células T compartilham um TCR heterodimérico composto por cadeias ab, mas uma pequena população de LT periféricos possuem TCR com diversidade limitada, composto por cadeias gd. Embora essas células reconheçam antígenos também pelo TCR, diferem dos LT ab, pois podem responder aos antígenos mesmo na ausência de apresentação antigênica via molécula de MHC, sendo então consideradas verdadeiras sentinelas do organismo. As células gd apresentam também memória imunológica, portanto são capazes de responder mais vigorosamente em um segundo encontro antigênico. Os LT gd exercem suas funções efetoras de maneiras variadas, podendo, por exemplo, apresentar citotoxicidade mediada por perforinas e granzimas (característica primária de LT CD8). Estudos terapêuticos têm explorado esta característica citotóxica contra antígenos tumorais. Os LT gd exercem também função auxiliar ao liberar citocinas, como INF-g (Th1) ou IL-4 (Th2), podendo inclusive atuar como APCs eficientes, pois possuem alta capacidade de apresentar antígenos aos LT ab, mediando sua ativação e proliferação. Os LT gd são também capazes de ativar células dendríticas e LB, ampliando assim tanto a resposta imune celular como humoral. Essas células são comumente encontradas nas primeiras linhas de defesa do organismo como as barreiras mucosas e a pele onde atuam como verdadeiras sentinelas de reconhecimento de padrões moleculares, reconhecendo, apresentando antígenos, respondendo a eles e contribuindo também para ativação e proliferação de células do sistema imune.

Os LT gd trazem à tona a discussão de um dos dogmas contemporâneos da imunologia, a divisão do sistema imune em sistema inato e adaptativo. O sistema imune inato responde rapidamente ao reconhecer padrões moleculares derivados de patógenos e é capaz de induzir as repostas imunes adaptativas pela liberação de citocinas e apresentação de antígenos. Em contraste, a reposta adaptativa age lentamente em um encontro antigênico inicial, mas desenvolve memória imunológica e responde rápida e vigorosamente em um encontro subseqüente. Os LT gd podem ser incluídos em ambos os braços da resposta imune uma vez que exercem tanto as funções de células da imunidade inata como da resposta adaptativa. Sua participação nos dois tipos de resposta sugere que essas células representam uma forma primitiva e conservada de imunidade.

Células T imuno-regulatórias

Várias evidências têm demonstrado a importância das diferentes populações de células T regulatórias em manter a auto-tolerância imunológica e seu papel no controle das respostas auto-imunes (Figura 5). Assim, há grande interesse em estudar a biologia dessas células, bem como sua potencial aplicação no tratamento das doenças auto-imunes.

As células com função imuno-regulatória apresentam como característica básica a capacidade de produção de citocinas imunossupressoras, como IL-4, IL-10 e TGF-b. Atuam em uma complexa rede de mecanismos regulatórios destinados a assegurar a modulação das respostas imunológicas frente aos diversos antígenos provenientes de agentes infecciosos, tumores, aloantígenos, auto-antígenos e alérgenos. Entre as células T com função imuno-regulatória estão as células T regulatórias de ocorrência natural (TREGS CD4+CD25+), descritas por Sakaguchi et al. (1995), células TR1 que regulam mediante a produção de IL-10 e suprimem o desenvolvimento de algumas respostas de células T in vivo, e as células Th3, capazes de regular o desenvolvimento de enfermidades auto-imunes mediante a produção de TGF-b. Têm sido relatadas ainda outras células T com função reguladora como as células T gd, células CD8+Qa-1+, os linfócitos T CD8+CD28- (CD8+ TR), as células NK/T e as células T duplo-negativas .

As células CD8+Qa-1+ têm recebido atenção recentemente como uma subpopulação celular importante no controle de processos auto-imunes. Esse efeito ocorreria mediante interação entre a molécula Qa-1 (HLA-E em humanos) e um grupo de receptores específicos presente em LT CD4 e células NK ativadas, gerando um sinal inibitório para essas células. Em camundongos foi demonstrado que células CD8+Qa-1+ foram capazes de regular o desenvolvimento da encefalomielite auto-imune experimental, gerando perspectivas para o tratamento dessa e de outras entidades auto-imunes a partir do foco nesta subpopulação celular. Outra fração de linfócitos que merece destaque são as células T gd, capazes de exercer ação regulatória sobre diferentes alvos celulares, apesar da inexistência de clareza quanto aos mecanismos responsáveis por tal efeito.

Figura 5 – Características gerais das células T com função imunorregulatória.

Células T regulatórias (Cd4+Cd25+) de ocorrência natural – TREGS

As TREGS representam 5% a 10% do total de células CD4+ no sangue periférico e podem também ser isoladas diretamente do timo. A origem tímica das TREGS foi descrita em camundongos, em que animais timectomizados no terceiro dia de vida tinham eliminadas as TREGS e desenvolviam síndromes auto-imunes. Outros estudos demonstram que as TREGS em humanos também são originadas no timo e que possuem características fenotípicas e funcionais semelhantes às observadas em camundongos. Foi demonstrado ainda que as TREGS presentes no timo são células naive e que se tornam ativadas, adquirindo fenótipo de memória, quando saem para a periferia.

Várias outras moléculas estão presentes nas TREGS, como HLA-DR, CD122, CD45Ro e o antígeno associado a linfócito T citotóxico (CTLA-4), presente intracelularmente. Essas moléculas podem ser induzidas também em outros tipos de células T CD4+, porém em menor intensidade de expressão do que ocorre nas TREGS. Essas células apresentam altos níveis de CD25 (CD25HIGH ou CD25BRIGHT) e expressam moléculas como CD45Ro, CD62L, CD122, HLA-DR, CD69 e CD71, entre outras. As células CD4+ com baixa expressão de CD25 (CD25LOW) são altamente heterogêneas em relação à expressão desses marcadores e os expressam transitoriamente. Shimizu e cols. (2002) relataram que as TREGS tam expressam o receptor para o fator de necrose tumoral a induzido por glicocorticóides (GITR).

Do ponto de vista molecular foi demonstrarado que o fator de transcrição Foxp3 é predominantemente expresso nas TREGS tímicas e periféricas. Células T CD4+CD25- naive forçadas a expressar o gene Foxp3 tornam-se anérgicas e passam a desempenhar papel supressor in vitro. Essas células adquiriram fenótipo semelhante ao das TREGS em relação à produção de citocinas e expressão de moléculas como CD25, CTLA-4, CD103 e GITR e tornaram-se capazes de suprimir a proliferação de outras células T e o desenvolvimento de doença auto-imune e doença inflamatória dos vasos in vivo. Estudos experimentais mostraram que camundongos deficientes para o gene FOXP3 apresentam hiperativação das células T.

Desta forma, Foxp3 parece ser um gene de grande importância no desenvolvimento e função das TREGS tanto em camundongos quanto em humanos. Têm sido descritos pacientes com mutação no gene FOXP3, que apresentam a síndrome denominada IPEX (desregulação imune, poliendocrinopatia, enteropatia, síndrome ligada ao X). Consiste em um distúrbio auto-imune que afeta múltiplos órgãos com desenvolvimento de alergia e doença inflamatória dos vasos. Aparentemente esses pacientes têm comprometimento no desenvolvimento das TREGS e conseqüente defeito na função supressiva, sendo induzido um estado de hiperativação das células T, que se tornam reativas contra auto-antígenos, bactérias comensais do intestino ou antígenos ambientais inócuos. O resultado é o desenvolvimento de poliendocrinopatia auto-imune, doença inflamatória dos vasos e alergia, respectivamente.

O interesse no estudo das células T regulatórias se deve à função chave dessa população celular na manutenção dos mecanismos de autotolerância e regulação da resposta imune. Várias evidências sugerem a relação das TREGS com o desencadeamento de doenças em que efetivamente há quebra da autotolerância. Entretanto, essas evidências foram alcançadas a partir de estudo em animais, demonstrando que tanto a remoção quanto a interferência no desenvolvimento dessa população celular pode resultar em alterações que induzem enfermidades auto-imunes. Ao transpormos as alterações observadas em animais para humanos, percebemos que o inadequado funcionamento das TREGS poderá estar relacionado à indução, intensidade e forma de evolução de diferentes patologias que acometem os seres humanos. Além de sua relação com distúrbios auto-imunes em condições em que sua função está ausente ou deficiente, existe interesse no seu estudo em outras situações onde observamos exacerbação da resposta imunitária. Por exemplo, podemos citar os transplantes, a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), os processos alérgicos, entre outras condições. Nessas situações, a abordagem terapêutica seria utilizar recursos que venham a estimular o número e a função dessas células a partir da administração de fármacos, citocinas, moléculas co-estimulatórias ou outros elementos que potencialmente atinjam esta finalidade.

Células T regulatórias nas doenças auto-imunes
Mecanismos de tolerância periférica parecem ser fundamentais na manutenção da tolerância e prevenção da auto-imunidade, uma vez que células auto-reativas podem ser detectadas na periferia, demonstrando que o mecanismo de seleção tímica, responsável pela eliminação dos clones de células T auto-reativas, é incompleto. As células TREGS apresentam propriedades fundamentais que suportam sua função na manutenção da tolerância periférica, como anergia frente à estimulação via TCR, inibindo a transcrição de IL-2 e a proliferação de células T CD4+ e células T CD8+ (fenótipos naïve e de memória). Essas células parecem regular também células apresentadoras de antígenos, como linfócitos B e células dendríticas.
Lindley e cols. (2005) realizaram um estudo avaliando a função supressora das TREGS em 21 pacientes com diabetes tipo I. Embora numericamente normais, essas células mostraram alterações funcionais, falhando em suprimir a proliferação de células CD4+CD25- co-cultivadas. As co-culturas apresentaram aumento de IFN-g e reduzidos níveis de IL-10 em relação aos controles normais, indicando falha funcional das TREGS desses pacientes na produção de citocinas antiinflamatórias bem como na supressão da produção de citocinas pró-inflamatórias. Esses estudos não são isentos de controvérsias, havendo relatos contraditórios de aumento e diminuição dos níveis de células CD4+CD25+ no diabetes mellitus. Provavelmente as discordâncias são decorrentes de variabilidades técnicas na análise por citometria de fluxo e nas variáveis relacionadas aos pacientes, como tempo de doença, número amostral, faixa etária, controles normais, entre outros. Entretanto, os autores estão em acordo quanto ao fato de que defeitos imuno-regulatórios da célula T estão diretamente ligados à patogênese do diabetes tipo I.

Putheti e cols. (2003), em estudo com 33 pacientes com esclerose múltipla, encontraram correlação entre elevadas proporções de TREGS no sangue periférico e intenso processo inflamatório, caracterizado por imagens de ressonância magnética. Também foram documentados defeitos funcionais das TREGS na síndrome poliglandular auto-imune tipo II (APSII). Os resultados relativos a outras doenças auto-imunes são variáveis. As TREGS derivadas de pacientes com tireoidite auto-imune e psoríase parecem apresentar capacidade supressiva reduzida (7% e 19%, respectivamente) enquanto aquelas derivadas de pacientes com doenças inflamatórias dos vasos e espondilite anquilosante apresentam forte capacidade supressiva (97% e 68%, respectivamente). Com relação à síndrome de Sjögren, um recente estudo não encontrou anormalidades numéricas nas TREGS em relação a doadores de sangue e a pacientes com lombalgia mecânica.

Finalmente, vale salientar que as anormalidades das TREGS podem ser mais sutis do que antecipamos. Em pacientes com artrite reumatóide, verificou-se que as TREGS foram incapazes de inibir a produção de TNF-a e IFN-g por células T efetoras e monócitos, mesmo com outras capacidades supressoras in vitro aparentemente normais. Outros autores encontraram que as TREGS no líquido sinovial de pacientes com artrite reumatóide estão em número aumentado em relação ao que se observa no sangue periférico. Contudo, as células respondedoras do fluído sinovial parecem ser menos susceptíveis à indução da supressão, indicando a presença de mecanismos complexos de resistência à supressão no sítio inflamado.

Diversas evidências indicando deficiências quantitativas e funcionais nas células T regulatórias têm sido apontadas em modelos experimentais de lúpus eritematoso sistêmico bem como na doença humana.

No lúpus eritematoso sistêmico (LES) em humanos, Crispin e cols. (2003) encontraram um defeito quantitativo nas TREGS dos pacientes com a forma ativa da doença em relação aos lúpicos com a forma inativa e a controles normais. Outro estudo, realizado por Liu e cols. (2004), avaliou a proporção de TREGS em 94 pacientes lúpicos, 52 portadores de artrite reumatóide e 50 controles normais, evidenciando significativa diminuição na proporção das células CD4+CD25+ no sangue periférico de pacientes com LES, o que não foi observado nos pacientes com artrite reumatóide. Esses resultados sugerem que a diminuição das TREGS pode ser uma característica específica da patogênese do LES. Os dados existentes desses dois estudos sobre a avaliação das TREGS no LES são relevantes e sugerem o envolvimento desta subpopulação celular nos mecanismos fisiopatológicos da doença.

A partir do estudo das células com função regulatória, abrem-se novas perspectivas para o entendimento dos mecanismos de regulação periférica e fisiopatologia nas diferentes enfermidades auto-imunes. Uma vez delineados os mecanismos imunológicos básicos de imunorregulação haverá subsídios para a elaboração de abordagens futuras de intervenção nessas doenças.

Células T regulatórias duplo negativas
A maioria das células T CD3+ TCRab expressam moléculas CD4 ou CD8. Entretanto, uma nova subpopulação de células T regulatórias com receptor TCRab mas CD4-CD8- foi descrita por Strober et al., em 1989. As células T duplo-negativas naturais periféricas com atividade supressora, denominadas células TREG DN constituem uma subpopulação de células presentes em tecidos linfóides e não linfóides. Existem em pequeno número, representando 1% a 2% dos linfócitos T periféricos em humanos, podendo estar aumentados em algumas doenças auto-imunes. Estudos têm demonstrado que as células TREGS DN são capazes de suprimir a reposta imune alogênica e xenogênica mediada por células T CD4+ e CD8+, assim como a resposta a antígenos próprios, ou seja, as células TREG DN têm um papel importante na regulação da resposta imune mediada por células T CD4+ ou T CD8+.

Wang R et al., 2002, demonstraram que células duplo-positivas quando estimuladas com antígenos de alta afinidade, em culturas celulares, poderiam apresentar acentuada redução na expressão de CD4 e CD8 e assumir um fenótipo de células TREG DN. No entanto, a origem in vivo das células TREG DN é ainda incerta. A análise de tecidos tem demonstrado que as células TREG DN estão presentes em nódulos linfáticos, medula óssea, timo, fígado e baço. Entretanto, alguns experimentos mostram que somente em fígado, nódulos linfáticos e medula óssea as células T DN possuem atividade supressora.

A maioria das células T CD4+ e CD8+ encontradas no sistema linfático periférico requer seleção tímica. Entretanto, alguns estudos sugerem que as células TREG DN poderiam ter sua maturação em órgãos extra-tímicos, tais como medula óssea e fígado, o que explicaria, em parte, a presença de células TREG DN em indivíduos e modelos murinos atímicos.

O estímulo das células TREG DN por antígenos específicos através do TCR é importante para o desenvolvimento da atividade regulatória. As células TREG DN são capazes de adquirir alopeptídeos de complexos peptídeo-MHC de células apresentadoras de antígenos (APCs) e apresentar esses peptídeos na sua superfície. A apresentação de aloantígenos nas células TREG DN permite a interação específica com células T efetoras reativas ao aloantígeno. Após esse contato com as células TREG DN, as células T efetoras progridem para morte celular mediada pela interação do FAS com seu ligante (FASL) e por outras vias não completamente identificadas.

Diferentemente das células CD4+ ou células T CD8+, sensíveis a apoptose, as células TREG DN são resistentes à morte induzida por ativação, tanto in vivo quanto in vitro. No entanto, os mecanismos que controlam a sobrevida e morte das células TREG DN maduras permanecem incertos, em parte devido ao pequeno número relativo destas células na periferia.

Similarmente às células TREGs CD4+CD25+, a supressão das células TREG DN também requer o contato célula-célula, embora apresentem um perfil de citocinas que as diferencia das células CD4+CD25+, Th1, Th2 ou Th3/Tr1. As TREG DN produzem predominantemente INF-g, TNF-a e pequena quantidade de TGF-b.

Em trabalhos realizados em modelos de infecção com Listeria monocytogenes tem sido demonstrado que as células T DN na cavidade peritoneal, após infecção, podem contribuir para uma proteção precoce às infecções bacterianas por secretar citocinas que induzem a ativação de macrófagos. Estes dados sugerem que as células T DN podem ter uma papel importante na defesa contra patógenos.

Na síndrome linfoproliferativa auto-imune (ALPS) tipo Ia, os pacientes têm um acúmulo de células T CD3+TCRab+ DN na periferia como resultado de um defeito de apoptose. Nesses pacientes uma mutação somática do gene FAS está presente caracterizando a doença. Acredita-se que o aumento do número de células DN nesses casos deva-se à perda das moléculas CD4 e CD8 pelos LT senescentes que falham em morrer por apoptose.

Dados recentes indicam que as TREG DN podem estar aumentadas em algumas doenças auto-imunes, talvez como uma tentativa de controlar as células efetoras. Sendo assim, a completa identificação e caracterização das células humanas TREG DN poderá ter implicações importantes no entendimento e tratamento de doenças auto-imunes e na rejeição de transplantes.

Células T regulatórias CD8+CD28-
As células T têm um papel importante em rejeição de aloenxerto agudo e crônico. Dois sinais são necessários para uma ótima ativação das células T. O primeiro sinal é gerado pela interação entre o receptor de células T (TCR), que reconhece antígenos sob a forma de peptídeos, exibidos pelos produtos dos genes do MHC próprio na superfície de células apresentadoras de antígenos (APCs). O segundo sinal é liberado pela interação de moléculas co-estimulatórias expressas em APCs que interagem com seus receptores presentes nas células T. Entretanto, algumas moléculas co-estimulatórias liberam sinais negativos que diminuem a resposta de células T tanto in vivo quanto in vitro. As interações de CD28-CD80 ou CD86 são bem caracterizadas e desempenham papel crítico na ativação de células T. A molécula co-estimulatória CD28 é necessária para iniciar a maioria das respostas das células T. Uma vez que a ativação ocorre, as células T tornam-se efetoras e/ou células de memória, importantes em mediar as respostas imunológicas. Por outro lado, as interações de CTLA-4-CD80 ou CD86 apresentam função inibitória, relevante para o controle da resposta imune a agentes externos e para a manutenção da tolerância periférica.

As células caracterizadas imunofenotipicamente como CD8+CD28- reconhecem especificamente antígenos expressos principalmente por células apresentadoras de antígenos (APCs) em associação ao MHC de classe I, mas não são ativadas, pelo fato de carecerem do receptor CD28. Ao invés, suprimem a resposta proliferativa de células T CD4+ alo-reativas nas imediações. Este efeito supressivo não é mediado por linfocinas, mas requer a interação célula-célula entre as células T helper CD4+, linfócitos T supressores CD8+CD28- e APCs apresentando antígenos alogenêicos.

O mecanismo de ação das células regulatórias CD8+CD28- não está completamente esclarecido e poucos estudos têm caracterizado a função dessas células regulatórias CD8+CD28- in vitro, mas sabe-se que, à semelhança das células TREG CD4+CD25+, que expressam Foxp3, as células regulatórias CD8+CD28-, após repetidos estímulos com antígenos apresentados pelas APCs, também expressam este marcador com importante papel na prevenção de auto-imunidade e na indução da autotolerância imunológica.

Figura 6 – Células NK/T. Reconhecimento de antígenos glicolipídicos apresentados pelas moléculas CD1d, resultando na ativação das células apresentadoras de antígenos (APCs) e outras células, como NK,LT e LB. A ativação é mediada pelas citocinas secretadas e pelas moléculas co-estimulatórias expressas. O perfil de citocinas secretado possui amplo espectro de efeitos, podendo ativar deste a imunidade mediada por células (resposta TH1) ou supressão desta resposta.

Células regulatórias NK/T
Praticamente todas as células que expressam TCRab são restritas ao MHC, ou seja, reconhecem o antígeno apenas em associação a moléculas do MHC próprio, e expressam co-receptores CD4 ou CD8. Uma pequena população de células T expressa marcadores encontrados em células natural killer (NK) e são conhecidas como células NK/T, que parecem também ter papel importante na regulação da resposta imune. Comparadas à população de células T, as células NK/T apresentam expressão quantitativa intermediária de TCR (TCRint), em que as cadeias a possuem diversidade limitada. Esses TCRs reconhecem lipídeos ligados a moléculas não polimórficas, semelhantes ao MHC da classe I, conhecidas como CD1.

As células NK/T parecem surgir do mesmo precursor de timócitos duplo-positivos que originam linfócitos T convencionais, mas são selecionadas positivamente após interações auto-reativas de alta avidez com glicolipídeos associados a moléculas CD1 expressos por células epiteliais ou medulares do tecido tímico. Tais interações não levam à eliminação dessas células, mas sim a uma alteração do programa celular resgatando as mesmas da morte por negligência.

Apesar do repertório limitado, as células NK/T apresentam duas diferentes estratégias no reconhecimento de patógenos. O primeiro mecanismo, observado no reconhecimento de bactérias gram-negativas, ocorre pela sinalização de receptores do tipo Toll (TLR) pelo LPS. O segundo mecanismo ocorre pelo reconhecimento específico de glicosilceramidas presentes na parede celular bacteriana, apresentadas por CD1d. Tal via de sinalização assegura o reconhecimento de patógenos que não apresentam ligantes para TLRs em sua parede celular.

As células NK/T são multifuncionais e podem aumentar a imunidade microbiana, realçar a resposta antitumor, reduzir a rejeição de aloenxertos, regular o desenvolvimento de doenças auto-imunes e promover a auto-tolerância. No entanto, podem também promover atividades deletérias ao indivíduo, por exacerbar a aterosclerose, processos alérgicos e algumas doenças auto-imunes através do perfil de citocinas secretadas (Figura 6).
Devido ao reconhecimento de glicolipídios conservados, tanto endógenos (iGbeta3) quanto exógenos, essas células estão envolvidas em respostas alérgicas, nflamatórias, tumorais e na auto-imunidade, além de participarem da regulação da resposta imune.

Figura 7 – Via de processamento de antígenos em moléculas MHC classe II. Os antígenos protéicos extracelulares são endocitados em vesículas, onde são clivados e degradados a peptídeos. As moléculas de MHC classe II são sintetizadas no retículo endoplasmático e liberadas em vesículas e a fenda de ligação dos antígenos é protegida por uma cadeia invariante. No momento da fusão das vesículas a cadeia invariante é degradada e retirada da fenda de ligação e os peptídeos são acondicionados na fenda. A molécula de MHC mais o peptídeo são transportados para a superfície celular para posterior apresentação aos linfócitos que expressam o receptor CD4.

Apresentação de antígenos e ativação de LT

A apresentação de antígenos aos LT inicia-se com o processamento antigênico por células apresentadoras de antígeno (APC), que consiste na captação do antígeno do ambiente extracelular ou intracelular, na sua degradação proteolítica a fragmentos menores, no transporte e acomodação desses peptídeos antigênicos na fenda das moléculas do MHC e finalmente na transposição do complexo MHC-peptídeo para a superfície celular para estarem disponíveis ao reconhecimento pelo receptor de linfócitos T (TCR). Deste modo as células T reconhecem via TCR o complexo MHC-peptídeo, independente do compartimento celular onde esse antígeno foi captado.

Normalmente os antígenos fagocitados ou endocitados seguem a via de processamento para antígenos exógenos e são acomodados em moléculas de MHC classe II, que interagem com o TCR e com o co-receptor CD4 na superfície celular. Os antígenos protéicos extracelulares são endocitados em vesículas, onde, pela ação das enzimas lisossomais são clivados e degradados em peptídeos. As moléculas de MHC classe II são sintetizadas no retículo endoplasmático e liberadas em vesículas com a fenda de ligação protegida por uma cadeia invariante (esta não apresenta polimorfismo). No momento de fusão das vesículas a cadeia invariante é degradada, retirada da fenda de ligação que então torna-se acessível para acondicionamento dos peptídeos. A molécula de MHC II com o peptídeo em sua fenda é transportada para a superfície celular para posterior apresentação do peptídeo a linfócitos que expressam o receptor CD4 como os linfócitos TH1, TH2, e T regulatórios (Figura 7).

Na via de processamento para antígenos intracelulares, as moléculas protéicas no citosol, como, por exemplo, os antígenos virais, são integradas à proteína ubiquitina e direcionadas para o proteassomo, uma unidade catalítica capaz de converter os antígenos citosólicos em peptídeos. Os peptídeos assim produzidos são conduzidos para o retículo endoplasmático e selecionados pelas proteínas associadas ao transporte (TAP1 e TAP2). Uma vez no retículo, os peptídeos são associados às moléculas de MHC I. Os complexos MHC I e peptídeo são transportados para a superfície celular para posterior apresentação aos linfócitos T CD8+ (Figura 8).

Para que ocorra a ativação dos LT, após o reconhecimento do peptídeo acoplado ao MHC I ou II pelo TCR, há necessidade de um segundo sinal, que é mediado pela interação de várias outras moléculas co-estimulatórias presentes na superfície tanto do LT quanto da APC (Figura 9). Por sua importância na regulação da resposta imune, destacamos as moléculas co-estimulatórias participantes da interação CD28-CD80 ou CD86, que resulta em sinais estimulatórios, e da interação CD28-CTLA4, que promove sinalização inibitória.

Figura 8 – Via de processamento de antígenos em moléculas MHC classe I. Os antígenos protéicos no citosol são ligados à ubiquitina e direcionados para o proteassoma, onde são convertidos em peptídeos. Os peptídeos são conduzidos ao retículo endoplasmático através do TAP1 e TAP2, onde são associados às moléculas de MHC I. Os complexos MHC I e peptídeo são transportados para a superfície celular para posterior apresentação do peptídeo aos linfócitos T CD8+.

Terapia biológica anti-célula T

A terapia com agentes biológicos direcionados para alvos terapêuticos em linfócitos T já foi bastante estudada. Os principais alvos são as moléculas de adesão presentes na superfície dessas células (CD3, CD4, CD5, CD7, CD40 ligante e CD25), contudo também se pode atuar indiretamente sobre a ativação dos linfócitos T através da inibição de sua interação com células apresentadoras de antígenos e com linfócitos B.

O abatacepte é o principal agente biológico atualmente em uso e atua inibindo a ativação de linfócitos T dependente da co-estimulação a partir de células apresentadoras de antígeno. O abatacepte é uma proteína solúvel de fusão que consiste no domínio extra-celular do CTLA-4 (cytotoxic-T lymphocyte-associated-antigen 4) ligada à porção Fc da IgG1 humana. O abatacepte inibe a ativação do linfócito T se ligando às moléculas CD80 e CD86 de células apresentadoras de antígenos, bloqueando a interação com a molécula de CD28 dos linfócitos T. Como o CTLA-4 tem afinidade para CD80 e CD86 muito superior à do CD28, ele previne a ligação de CD80/86 a este último, impedindo assim a deflagração do segundo sinal, fundamental para a ativação do linfócito T. O abatacepte foi amplamente estudado na artrite reumatóide (AR) e tem eficácia comprovada em diversos ensaios clínicos. Seu uso é indicado para pacientes com AR que não obtiveram controle adequado da doença com drogas modificadoras da doença e agentes anti-TNFa. Alguns estudos estão em andamento para avaliar a eficácia do abatacepte no lúpus eritematoso sistêmico.

O belatacepte é uma molécula semelhante ao abatacepte que apresenta afinidade dez vezes maior para a interação com as moléculas CD80 e CD86 em relação a este. Alguns estudos em pacientes submetidos a transplante renal têm demonstrado eficácia semelhante à da ciclosporina para evitar a rejeição aguda.

O alefacepte é outro agente biológico que inibe a interação entre células apresentadoras de antígeno e linfócitos T. Ele é uma proteína de fusão dimérica composta pela porção extra-celular da LFA-3 (leukocyte function antigen-3) e a porção Fc da IgG1. O alefacepte inibe a interação da LFA-3 com a molécula de CD2 presente no linfócito T e bloqueia conseqüentemente a ativação deste. Este agente é utilizado no tratamento da psoríase em pacientes com lesões crônicas e indicação de terapia sistêmica ou de fototerapia.
O efalizumabe é um anticorpo monoclonal contra a LFA-1 (leukocyte functional antigen 1) que é uma molécula de adesão presente no linfócito T e que se liga à ICAM-1, permitindo a migração do linfócito T ativado da corrente sangüínea para os tecidos. O efalizumabe é atualmente indicado no tratamento da psoríase.

Anticorpos anti-CD40L (ligante) foram desenvolvidos com o objetivo de se inibir a estimulação de linfócitos T pelas células apresentadoras de antígeno e de linfócitos B pelos linfócitos T. Dois anticorpos monoclonais anti-CD40L foram estudados em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES). O anticorpo Hu5c9 foi estudado em pacientes com nefrite lúpica e apresentou bons resultados, mas o estudo foi suspenso devido a ocorrência de eventos tromboembólicos. O outro anticorpo anti-CD40L (IDEC 131) também foi estudado em pacientes com nefrite lúpica, mas não apresentou benefícios.

Figura 9 – Processamento do antígeno por linfócito B, apresentação ao linfócito T CD4+ com conseqüente ativação celular. Visão esquemática das moléculas envilvidas na ativação dos linfócitos. Na parte inferior da figura estão esquematizados alguns exemplos de imunomoduladores com seus respectivos alvos.

Terapia anti-linfócito T, cujos alvos específicos encontram-se em sua superfície, pode ser dividida em depleção e em modulação de sua função. Diferentes agentes biológicos foram desenvolvidos para depleção de linfócitos T. O primeiro foi o anticorpo monoclonal anti-CD7, mas a falta de eficácia do anticorpo murino e quimérico em pacientes com artrite reumatóide (AR) fez com que estudos subseqüentes fossem abandonados. CD5 plus é um conjugado imune composto por um anticorpo monoclonal murino anti-CD5 e a cadeia A da ricina. Embora estudos abertos tenham demonstrado resultados promissores, um ensaio clínico controlado e randomizado não demonstrou benefícios na AR. Outro anticorpo monoclonal murino testado na AR foi o anti-CD4 (cM-T412), mas estudos clínicos com este anticorpo não demonstraram eficácia, apesar de terem obtido depleção de linfócitos T CD4+.

Quatro anticorpos monoclonais anti-CD4 não depletores de linfócitos T, ou seja, moduladores de sua função foram desenvolvidos. Os compostos 4162W94 e IDEC-CE9.1/SB-210396 foram os primeiros a serem investigados, mas suas pesquisas foram suspensas devido à grande depleção de linfócitos T e aos eventos adversos. Pesquisas com os compostos não depletores de linfócitos T Humax-CD4/HM6G IgG1 anti-CD4 e o anti-CD4 Mab OKT4-cdr4a estão em andamento. Em modelos experimentais de transplante, o uso combinado de anticorpo não depletor anti-CD4 YTS177 e anti-CD8 YTS105 vem sendo estudado com bons resultados.

O visilizumabe é um anticorpo monoclonal anti-CD3 humanizado que induz a apoptose de linfócitos T ativados e diversos estudos demonstraram segurança e eficácia na prevenção da doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) e no tratamento da doença inflamatória intestinal. O muronomabe (OKT3) é outro anticorpo anti-CD3 utilizado em pacientes tranplantados para a prevenção de rejeição do transplante.

O receptor da interleucina-2 (IL-2) em linfócitos T ativados (CD25) também foi alvo terapêutico em alguns estudos. O IL2-DAB (IL-2 recombinante humana conjugada à cadeia alfa da toxina difitérica) apresentou bons resultados em estudo que avaliou pacientes com AR, mas houve alta freqüência de elevação de enzimas hepáticas. O basiliximabe é um anticorpo monoclonal quimérico anti-receptor da IL2 em linfócitos T ativados que vem sendo utilizado para evitar a rejeição em pacientes submetidos ao transplante renal.

O uso de anticorpos monoclonais anti-TCR (T cell receptor) constitui uma perspectiva terapêutica futura. Bons resultados foram obtidos em estudo que avaliou os anticorpos anti-TCR em modelo experimental de hiperreatividade de vias aéreas.

Estes são exemplos das múltiplas aplicações clínicas da terapia biológica voltada para o linfócito T, tanto na reumatologia quanto em diversas especialidades clínicas. Diversas moléculas desenvolvidas com esse fim foram descartadas por falta de eficácia ou por efeitos colaterais inaceitáveis. Entretanto, novas perspectivas terapêuticas voltadas para a imunomodulação e ou depleção de linfócitos T continuam a ser estudadas em diversas doenças auto-imunes.