Figura 1 – Esquema de iniciação do processo aterogênico como oxidação da molécula de LDL-c, formação das células espumosas com resultante redução e obstrução da luz do vaso.

HIPÓTESE DA MODIFICAÇÃO OXIDATIVA DA ATEROSCLEROSE

A hipótese oxidativa da aterosclerose postula que a partícula de LDL-c deve ser submetida a algum tipo de modificação estrutural antes de se tornar totalmente pró-aterogênica(8). Diversos autores consideram a modificação oxidativa da LDL-c importante e, possivelmente, obrigatória na patogênese da doença(5,6).

Para tanto, as lipoproteínas atravessam as células endoteliais por transporte vesicular, o qual não requer receptores. Existem fortes evidências de que as LDLs plasmáticas, na sua relação normal com a parede dos vasos, atravessam as células endoteliais através de mecanismo de endocitose. Simionescu et al.(9) demonstraram a formação de invaginações na membrana da célula endotelial chamadas de coated pits, onde localizar-se-iam os receptores específicos da apo B-100. Estas invaginações se transformam em vesículas de endocitose, carreando as partículas de LDL-c para o interior da célula endotelial. O aumento da concentração de LDL-c nativa no interior das células endoteliais induz ao maior consumo de óxido nítrico e de acentuada produção de radicais livres. Cerca de 10% das partículas de LDL atingem a camada íntima do vaso(9).
Na íntima, essas LDL-c são aprisionadas numa trama de fibras e fibrilas secretadas pelas células parietais(9,10). As LDL-c nativas são reconhecidas e não se acumulam em quantidade apreciável nos macrófagos. As lipoproteínas captadas na íntima subendotelial podem ser modificadas por oxidantes ou enzimas derivadas quer das células endoteliais, monócitos ou células do músculo liso. A modificação oxidativa da LDL-c parece ocorrer em dois estágios. O primeiro estágio ocorre antes que os monócitos sejam ativados, resulta na oxidação dos lípides da LDL-c, com pequena alteração na apo B-100 (LDL-c minimamente oxidada – MM-LDL-OX). O segundo estágio começa quando os monócitos são ativados e convertidos em macrófagos, que contribuem com sua grande capacidade oxidativa. Nesse estágio, os lípides da LDL-c e a fração protéica (apo B-100) são totalmente oxidados. Desse modo, a partícula de LDL-ox consiste de componentes pró-oxidantes, incluindo hidroperóxidos de ácidos graxos e fosfolipídios, bem como um componente maior, produto do ácido linoléico, o 13-hidroperoxioctadecadienoico (-13-HPODE). A partir destas modificações, a partícula passa a ser reconhecida por receptores acetilados e CD-36 na superfície dos macrófagos(11,12). Tais receptores não são regulados pela concentração intracelular de colesterol. Como resultado, a internalizarão da LDL-ox é extremamente arriscada, visto que nas células que aprisionam esta partícula, os macrófagos, faltam o mecanismo de feedback encontrado em todas as outras células. Este mecanismo desencadeia o fenômeno de inibição da síntese de receptores de LDL-c. No macrófago, inexistindo esta regulação, há uma contínua internalização de LDL-ox levando ao ateroma. Esta captação da LDL-ox torna mais suscetível à agregação e formação de células espumosas(11) (Figura 1).

Alguns efeitos pró-aterogênicos da LDL-ox são descritos a seguir(7):

· A LDL minimamente oxidada aumenta a adesão dos monócitos ao endotélio;
· A LDL minimamente oxidada induz a expressão da proteína -1 quimiotáxica de monócitos e fatores estimulantes da colônia de granulócitos-macrófagos;
· A LDL oxidada é quimiotáxica aos monócitos, células do músculo liso e linfócitos T; e a induz a ativação de células T e a diferenciação dos monócitos;
· A LDL oxidada é degrada pelos macrófagos em um ritmo mais rápido do que a LDL nativa, levando ao acúmulo de lípides;
· A LDL oxidada inibe a motilidade dos macrófagos, aprisionando, em potencial, os macrófagos na artéria;
· A LDL oxidada inibe o fator de relaxamento endotélio-dependente;
· Os componentes da LDL são citotóxicos para as células;
· A LDL oxidada inibe a migração de células endoteliais;
· A LDL oxidada induz a expressão de moléculas de adesão ao endotélio;
· A LDL oxidada estimula a via de produção de óxido nítrico, comprometendo a função endotelial;
· Os componentes da LDL oxidada induzem a síntese e secreção de interleucina-1 pelos macrófagos.

Alguns destes efeitos são corroborados por Napoli et al.(13) quando observaram, através de uma série de secções histológicas em aortas fetais (fetos abortados espontaneamente ou falecidos 12 horas depois do nascimento) de mães normocolesterolêmicas e hipercolesterolêmicas, que o acúmulo de lipoproteínas de baixa densidade e a sua oxidação precede o recrutamento de monócitos em lesões ateroscleróticas iniciais. Em 58,6% dos sítios aterogênicos avaliados continham macrófagos, células espumosas e LDL-ox; em 17,3% de todos os sítios continham somente LDL nativa; e em 13,3% continham somente LDL-ox sem monócitos e macrófagos. Entretanto, somente 4,3% dos sítios continham monócitos isolados na ausência de LDL nativa ou oxidadas. Adicionalmente, 6,3% dos sítios continham LDL e macrófagos, mas poucos subprodutos da lipoperoxidação (malondialdeido, 4-hidroxinonenal-lisina). Estes resultados esclarecem o fato de que em lesões iniciais, freqüentemente, é encontrada LDL-c nativa e oxidada na ausência de monócitos/macrófagos, enquanto que oposto é raro, sugerindo que o acúmulo de LDL-ox contribui para o recrutamento in vivo de monócitos. E que ambos os fenômenos de oxidação da LDL e a formação de estrias gordurosas são grandemente aumentadas em presença de hipercolesterolemia maternal. Estas evidências experimentais sugerem que a modificação oxidativa da partícula de LDL desempenha um papel fundamental na fisiopatologia da aterogênese.

Hulthe et al.(14), em um estudo realizado em indivíduos clinicamente saudáveis, relataram que a LDL-ox estava relacionada com o grau de espessura da íntima-média (IMT) e com a ocorrência de placa nas artérias carótidas e femural. Adicionalmente, a LDL-ox foi associada com fator de necrose tumoral a (TNF-a), proteína C-reativa, LDL-c, mas não com pressão arterial e tabagismo. Quando ajustadas para outros fatores de riscos, ambos LDL-c e LDL-ox pareceram ser preditores independentes para ocorrência de placa nas artérias carótidas e femural.

Na tentativa de elucidar um possível papel da LDL-ox na instabilidade da placa em doença arterial coronariana, Shoichi et al.(15) mensuraram os níveis plasmáticos de LDL-ox em 210 pacientes, sendo 70 com infarto agudo do miocárdio (IAM), 70 com angina instável (AI) e 70 com angina estável (AE), contra 55 pacientes-controle (C). Além disso, os autores avaliaram se existia relação entre níveis de LDL-ox e diabetes mellitus (DM) em pacientes com doença arterial coronariana e também os níveis de LDL-ox em pacientes que morreram de IAM. Os resultados obtidos indicaram que os níveis plasmáticos de LDL-ox em pacientes com IAM foram significativamente mais elevados do que em pacientes com AI, AE e no grupo-controle. No grupo AI, os níveis plasmáticos de LDL-ox em paciente com DM foram significativamente mais elevados do que aqueles sem DM. Já os pacientes que morreram de IMA, submetidos à autópsia, revelaram um aumento nos níveis plasmáticos de LDL-ox e os testes imunoistoquímicos das coronárias mostraram que haviam abundantes células espumosas derivadas de macrófagos, indicando diferenças positivas entre LDL-ox e CD 36. Estes achados indicam que a LDL-ox está intimamente relacionada com processos inflamatórios associados à lesão aterosclerótica. Além de sugerirem que existe uma ligação entre altos níveis de LDL-ox e hiperglicemia, isso porque foi observado um aumento nos níveis de LDL-ox na presença de glicose. Acima de tudo, estes resultados realçam o papel a LDL-ox no risco de DM e na gênese da instabilidade da placa em tratando-se de doença arterial coronariana. Corroborando o achado de associação ente LDL-ox e diabetes mellitus, Gottlieb et al., 2004, demonstraram em um estudo de caso-controle que indivíduos com níveis de LDL-ox acima de 0,5 nmol/mg de apoproteína têm uma razão de chance de 3,575 (IC 95%= 1,737 – 7,358) de terem diabetes mellitus em relação ao grupo-controle(16).

As LDLs-ox são moléculas biologicamente ativas e potentes agentes pró-inflamatórios na parede das artérias, bem como imunogênicas na presença de anticorpos anti-LDL-ox encontrados na circulação e nas placas ateroscleróticas(17,18). Estas evidências suportam estudos casos-controle e prospectivos que demonstram que o aumento nos níveis de anticorpos anti-LDL-ox estão associados com futuro infarto do miocárdio(17). Além disso, Tornvall et al.(18), em um estudo de caso-controle (88 pacientes com infarto do miocárdio antes dos 45 anos de idades e 88 indivíduos-controle saudáveis), para avaliar a importância de diferentes tipos de anticorpos contra LDL-ox em pacientes com doença arterial coronariana, demonstraram que os casos tinham mais anticorpos contra a LDL-ox do que os indivíduos-controle. Inversamente, nenhuma associação foi encontrada entre diferentes tipos de anticorpos para LDL-ox e severidade de aterosclerose coronariana ou número e severidade de estenoses e prognósticos. Portanto, o valor prognóstico dos anticorpos anti-LDL-ox é limitado em pacientes jovens pós-infarto e os resultados indicaram que os anticorpos anti-LDL-ox não são protetores em estágios tardios da aterosclerose coronária.

De modo geral, estes estudos, acima de tudo, mostram que a LDL-ox tem poder preditivo para o desenvolvimento da doença aterosclerótica independente dos fatores de risco cardiovasculares clássicos.

O PAPEL DO ESTRESSE OXIDATIVO E DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE NA ATEROSCLEROSE

Nos organismos aeróbios a maior parte do oxigênio é reduzida a água dentro da mitocôndria, através da enzima citocromo oxidase, que transfere quatro elétrons ao oxigênio. Entretanto, em decorrência da sua configuração eletrônica (triplet 302), cerca de 5% do oxigênio que se consome tem forte tendência a receber um elétron de cada vez, ou seja, a transferência de elétrons pode ser realizada em passos monoeletrônicos, com a formação de espécies intermediárias(19). Deste modo, aproximadamente 5% de todo o oxigênio consumido é convertido em ânion superóxido (O-2), que é um radical livre (RL). Os radicais livres (RL) são conhecidos pelos químicos orgânicos há muitas décadas, porém só recentemente os radicais livres tiveram sua importância avaliada em bioquímica e medicina, pois estão envolvidos em processos como a toxicidade do oxigênio, reações inflamatórias, injúria por reperfusão, câncer e envelhecimento(19,20). Os radicais livres são definidos como um átomo, grupo de átomos ou moléculas com um elétron desemparelhado ocupando um orbital mais externo, sendo, por convenção, representados por x. Essa definição inclui íons de metais de transição, o átomo de hidrogênio, o óxido nítrico e o dióxido de nitrogênio.

A toxicidade do oxigênio não se deve apenas aos RL dele derivados, mas também a outros estados do oxigênio, como o radical hidroxila (OH), o oxigênio singlet (1O2), o óxido nítrico (ON), radicais peróxidos (ROOH-), peróxidos nitritos (ONOO-), ácido hipoclórico (HOCl-) e peróxido de hidrogênio (H2O2), este último também é considerado uma EAO, apesar de não possuir um elétron desemparelhado na última órbita(21). Dentre as EAOs, o peróxido de hidrogênio (H2O2) é a mais estável e menos reativa. A hidroxila (OH) é a EAO mais reativa, menos estável e mais perigosa do ponto de vista biológico, pois reage imediatamente após sua formação com qualquer molécula biológica ao seu redor. Além disso, diferentemente do peróxido de hidrogênio e do ânion superóxido, não existem defesas enzimáticas contra este radical. Os principais alvos das EAO nas células são os lípides, as proteínas contendo grupamento sulfidril e o DNA(19).

Uma fonte considerável de EAO é o chamado “vazamento univalente” de radical superóxido do sistema de transporte de elétrons mitocondrial. Este radical superóxido também é produzido pelo sistema NADH/NADPH oxidase, presente na superfície de células inflamatórias, como neutrófilos, eosinófilos, monócitos e macrófagos. Neste caso a produção respiratória de EAO é importante para o sistema imune(19).

O estresse oxidativo é resultado do desbalanço no status redox da célula devido ao aumento das concentrações de EAOs ou à diminuição na atividade de um ou mais sistemas antioxidantes, ou seja, sob determinadas condições patológicas, a taxa de produção de EAOs é maior que a resposta antioxidante, alterando o balanço oxidante-antioxidante(21).

Diversas evidências apontam que o estresse oxidativo desempenha um papel importante em várias condições clínicas(19-21). Por isso, tem se levantado a hipótese que o estresse oxidativo também pode ser considerado um fator de risco e pode estar relacionado com a etiologia de doenças que estão fortemente centradas na homeostasia e funcionamento celular, como é o caso de algumas doenças cardiovasculares(21,22), diabetes mellitus(23), das neoplasias(24) e de doenças neurológicas(25).

Dröge postula que estas doenças estejam separadas em duas grandes categorias: 1) a primeira categoria pode ser referida como estresse oxidativo mitocondrial, em que se encontram o diabetes mellitus e as neoplasias e que apresentam comumente mudanças pró-oxidativa no estado redox sistêmico; 2) a segunda pode ser referida como condições inflamatórias oxidativas, pois é tipicamente associada com uma excessiva estimulação da atividade da NADH/NADPH oxidase através de citocinas ou outros agentes. Neste caso, o aumento nas taxas de produção de EAOs ou mudanças nos níveis de glutationa estão freqüentemente associados às condições patológicas, como, por exemplo, a aterosclerose(21).

A elaboração de um modelo de regulação da função e estrutura vascular centrado em processos redox foi um dos mais significativos avanços da fisiologia vascular. A idéia de que um simples intermediário químico fosse capaz de exercer transdução de sinais biológicos específicos de modo autócrino (na própria célula de origem) ou parácrino (em células fisicamente contíguas) foi logo estendido as EAOs.

O radical superóxido reage muito rápido com o óxido nítrico, não apenas inibindo a sua bioatividade, mas gerando outras espécies ativas, como o peroxinitrito. O equilíbrio entre estes intermediários é um fator determinante da função celular, por meio de regulação de certas proteínas específicas ou de lípides. Dessa forma, a disfunção endotelial/vascular pode, sob vários ângulos, ser resumida como uma disfunção da sinalização redox vascular.

Vias enzimáticas de produção de EAOs em sistemas vasculares
Enquanto as vias enzimáticas de produção de óxido nítrico (ON) estão bem caracterizadas, com três isoformas conhecidas das NO sintetase (neuronal ou NOS1, induzível ou NOS2 e endotelial NOS3), as enzimas responsáveis pela geração de superóxido e água oxigenada nos vasos estão ainda por serem esclarecidas. Fica claro, entretanto, que tais enzimas e os mecanismos que as regulam são elementos interativos importantes na sinalização e, em última análise, no ambientes redox celular. As principais fontes de produção de EAOs estão listados no Quadro 1(19,21).

Deste modo, desde o final da década de 80, tem se dado relativa importância à ação do estresse oxidativo e espécies ativas de oxigênio (EAOs) sobre as biomoléculas, especialmente, sobre as LDL-c, como uma das maiores causas de disfunção endotelial na aterogênese. Evidências científicas sustentam a noção que o estresse oxidativo e a produção de EAOs funcionam como reguladores fisiológicos da expressão de genes que atuam no sistema cardiovascular, via rede regulatória transcricional e sinal de tradução redox-específico(22). Acima de tudo, o estresse oxidativo contribui para aterogênese, induzindo a lipoperoxidação e a expressão de várias citoquinas e moléculas de adesão, promovendo, assim, a invasão de células inflamatórias para a camada íntima dos vasos, o qual é considerado um prematuro e importante evento no processo aterogênico(22).

Estudos clínicos associados à ingestão de compostos antioxidantes
Os antioxidantes podem ser compostos moleculares de origem exógena, como as vitaminas, obtidos através da alimentação ou enzimas endógenas do sistema de defesa antioxidante. Os antioxidantes impedem que o oxigênio se combine com moléculas suscetíveis ou neutralizem a formação de radicais livres e espécies ativas de oxigênio, formando compostos menos reativos.
Os antioxidantes exógenos, obtidos de alimentos basicamente de origem vegetal, podem ser extremamente benéficos com a adoção de uma dieta saudável (composta de todos os nutrientes essenciais para o bom desempenho orgânico), tendo um papel crucial na prevenção de processos deletérios das EAOs no organismo, minimizando seus efeitos. Uma dieta rica em frutas e vegetais pode minimizar o estresse oxidativo e a produção das EAOs pela alteração do balanço entre atividades celulares pró-oxidantes e defesas antioxidantes(24). Isto porque, as frutas e os vegetais possuem compostos com propriedades antioxidantes, tais como flavonóides (atividade antioxidante potente, atribuída aos radicais polifenólicos; quercitina remove radicais superóxido, oxigênio singlet e peróxidos lipídicos e inibem oxidação das LDL e a atividade citotóxica das LDL-ox) e a vitamina C, entre outros. A vitamina C é um antioxidante hidrossolúvel capaz de remover os radicais superóxido, hidroxila e oxigênio singlet, além de preservar os níveis de vitamina E e beta-caroteno durante estresse oxidativo(24).

A vitamina E, há alguns anos, tem recebido especial atenção devido à sua potencial capacidade antioxidante. Alguns estudos sugerem que a administração de vitamina E inibe a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL-c), prevenindo a formação de placas ateroscleróticas. Além disso, outras substâncias, como t-resveratrol (encontrado no vinho), vitamina C e beta-carotenos, também têm potencial antioxidante, bem como uma atividade antiaterogênica(26,27).

Em um estudo randomizado, duplo-cego, realizado em crianças com hiperlipidemia, foi observado que os efeitos da administração de vitamina C (500 mg/d) e vitmaina E (IU/d) por seis semanas restaurou a função endotelial. Porém, o dado mais interessante deste estudo foi que a detecção precoce e o tratamento da disfunção endotelial em crianças com hiperlipidemia ou com história familial de hipercolesterolemia podem retardar a progressão da aterosclerose em idades mais avançadas(27).

Por outro lado, diversos ensaios clínicos, duplo-cego, placebo-controlado e de larga escala têm mostrado que nem o beta-caroteno nem a vitamina E, administrados sozinhos ou em combinação com outros antioxidantes reduzem o risco de infarte fatal ou não fatal em indivíduos com doença cardiovascular, e pode até aumentar o risco(28,29).

Contudo, outros estudos, principalmente metanálises de ensaios clínicos randomizados, indicam que o uso indiscriminado de suplementos vitamínicos contendo beta-carotenos e vitamina A deveriam ser desencorajados, pois estes compostos estão associados com uma pequena, mas significativa parcela de todas as causas de mortalidade, primordialmente as ligadas as DCVs. Além disso, a suplementação com vitamina E em pacientes com doença cardiovascular não deve ser recomendada, pois pode embotar a eficácia de terapias hipolipemiantes com estatinas e niacina(30).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A partir deste volume substancial de evidências, parece que a LDL-ox está envolvida na ativação de vários componentes vasculares (células endoteliais, macrófafos, células do músculo liso etc.) e induz diversos genes pró-aterogênicos (ICAM-1, VCAM-1, PDGF-A-B, eNOS etc.) imprescindíveis para o início da cascata de eventos que desencadearam o processo aterogênico. Aliado aos aspectos pró-inflamatórios da LDL-ox, a noção de que estresse oxidativo contribui para a patogênese da doença vascular tem ocupado um papel importante. Recentemente, tem se tornado claro que a relação entre estresse oxidativo e doença vascular vai além da oxidação da LDL e envolve produção celular de espécies ativas de oxigênio (EAOs) e o aparato antioxidante (endógeno e exógeno). Deste modo, a disfunção endotelial/vascular pode, sob vários ângulos, ser resumida como uma disfunção da sinalização redox vascular.
Outra questão importante e deveria ser levada em consideração diz respeito ao método utilizado para se obter a LDL-ox e ao valor do ponto de corte para a LDL-ox. Apesar existirem diversos estudos mostrando que níveis elevados de LDL-ox estão associados a um risco aumentado de desenvolver uma doença cardiovascular, no entanto não existe um consenso com relação à origem da LDL-ox (plasmática ou a fagocitada pelo macrófago) e para o valor de referência para as dosagens de LDL-ox. Isto é, qual o melhor método para se obter a LDL-ox, a circulante no plasma ou a que está depositada nos vasos? A LDL-ox deve ser mantida em que nível desejável? Acima de que valor a LDL-ox se torna prejudicial à saúde?

Entretanto, ainda que não exista um consenso sobre estas questões, ainda assim é possível inferir que os níveis alterados de LDL-ox podem ser utilizados para identificar indivíduos com risco cardiovascular dentro de uma população, mesmo antes de algum evento ocorrer. Portanto, seria relevante que se incorporasse gradativamente a medida da LDL-ox como mais uma ferramenta de diagnóstico precoce para a prevenção e detecção de doenças cardiovasculares, na tentativa de intervir na evolução do processo aterosclerótico para desfechos importantes, como infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral, que são as maiores causa de morbimortalidade em diversos países.